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Modèle pot de départ pour mutation

2019 February 15
by Randy H. Milgrom

«Grâce à nos recherches, nous avons constaté que les cancers et les maladies étaient probablement causés par des mutations cellulaires résultant de propriétés du cannabis ayant une interaction chimique avec l`ADN d`une personne», a déclaré le professeur agrégé Reece. Comme la mutation identifiée est présente dans l`hétérozygose chez tous les transporteurs analysés, nous émettons l`hypothèse que la protéine POT1R117C fonctionne de façon dominante négative. Pour valider cette possibilité, nous créons des lignées cellulaires hétérologues hela utilisant des vecteurs rétroviraux pour exprimer WT MYC-POT1, MYC-POT1R117C et MYC-POTΔOB1 alleles26 en présence de POT1 endogènes. L`analyse de la microscopie à double immunofluorescence avec les anticorps MYC et TRF1 des cellules HeLa a montré que les protéines myc-POT1ΔOB1 de WT et de mutant, mais aucune cellule exprimant l`épitope MYC seul (vecteur vide) montrent la colocalisation des protéines télomériques MYC-POT1 et TRF1 . Les cellules HeLa exprimant le MYC-POT1R117C montrent un schéma similaire à celui qui exprime le vecteur seul et seules quelques cellules présentent peu de foyers MYC qui sont colocalisés avec TRF1 (Fig. 5a, b). La quantification de l`intensité nucléaire de TRF1 n`a révélé aucune différence significative entre les cellules HeLa exprimant soit le vecteur vide, soit les allèles POT1 du WT et du mutant (Fig. 5a, b). Une diminution de la quantité de télomère liée à la protéine MYC-POT1R117C dans les cellules HeLa est en accord avec la diminution de la quantité de protéine observée dans les lymphocytes par l`immunofluorescence et l`analyse des puces à l`aide d`anticorps POT1 (Fig. 3A – c).

Utilisant une technique génétique différente — en regardant les points de mutation appelés polymorphismes de nucléotides uniques — Gaudino, page, et McKernan ont commencé à construire un arbre évolutif brut pour le cannabis. (Plus les SNP partagent deux souches, plus ils sont étroitement apparentés.) Plus concrètement, les SNP peuvent distinguer une souche d`une autre. Génomique médicinale, colline escarpée, et Phylos Bioscience ont tous des produits d`identification de souche sur la façon de lutter contre les contrefaçons. Vous ne pouvez pas breveter un produit illégal; la détention sur IP dans le commerce des mauvaises herbes est assez difficile. POT1 est recruté au télomère par l`interaction avec TPP1 (Réf. 13). Les niveaux réduits de POT1 liés au télomère observés chez les porteurs de mutations (Fig. 3A – c), ainsi que l`analyse in silico (tableau supplémentaire 4) suggèrent que POT1R117C pourrait être défectueux dans la liaison TPP1.

Pour tester cela, nous avons effectué des essais de co-immunopréprécipitation avec des POT1R117C marqués par MYC et marqués par un drapeau TPP1. En tant que témoins, nous avons utilisé MYC-Tagged WT POT1 et un mutant MYC-POT1ΔOB1 qui a été montré pour être défectueux dans la liaison d`ADN simple brin, mais fonctionnel dans son interaction avec TPP1 (Ref. 12). En outre, nous avons également utilisé un TPP1OBD mutant FLAG-Tagged qui manque à la fois l`interaction POT1 et TIN2 domain27.

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